En estos estudios, sometimos el 25% de las proteínas mitocondriales y zapatillas puma ferrari el 2.5% de las proteínas no mitocondriales a la transferencia Western. Las señales de banda de PUMA mitocondrial y PUMA no mitocondrial se determinaron densitómicamente usando el software NIH ImageJ, como describimos previamente [31]. Posteriormente, se calculó el alcance de la translocalización mitocondrial PUMA, designada como índice mtPUMA, utilizando la ecuación a continuación. Examinamos un panel de ocho GBM y dos líneas celulares AA para la expresión de EGFR / EGFRvIII y miembros proapoptóticos de la familia de proteínas Bcl-2 . Como se muestra en la Fig. 1a, la mayoría de estas líneas celulares coexpresan altos niveles de EGFR y tres proteínas proapoptóticas, a saber, PUMA, Bax y Bmf.

En contraste, estas células expresan bajos niveles de Bad, Bim y Bok. Para determinar si EGFRvIII también coexpresa con proteínas proapoptóticas similares a EGFR, examinamos tres xenoinjertos GBM que llevan EGFRvIII ya que la expresión de EGFRvIII no se mantiene in vitro [35]. Los resultados (Fig. 1b) mostraron zapatillas puma blancas que estos xenoinjertos GBM que expresan EGFRvIII también expresan PUMA, Bax y Bmf. También determinamos los niveles de expresión de PUMA en xenoinjertos de GBM con niveles altos y bajos de EGFRvIII y los resultados (Fig. S1 en Datos suplementarios) mostraron que el xenoinjerto de MG D-317 coexpresó EGFRvIII y PUMA y que D-320 MG y puma chanclas mujer D-456 Los xenoinjertos MG con expresión indetectable de EGFR / EGFRvIII expresaron PUMA a niveles bajo y alto, respectivamente.

EGFR y EGFRvIII coexpresan paradójicamente con proteínas proapoptóticas e interactúan específicamente con PUMA en GBM. (A) Expresión de EGFR y proteínas proapoptóticas en líneas celulares de glioma maligno humano. Los extractos celulares totales aislados de ocho GBM y dos líneas celulares AA se sometieron a transferencia Western para determinar los niveles de la familia de proteínas proapoptóticas EGFR y Bcl-2, incluyendo Bad, PUMA, Bax, Bim, Bmf y Bok. La ±-tubulina se determinó como controles de carga. Líneas celulares: 1, UW14; 2, UW281; 3, MGR1; 4, MGR2; 5, MGR3; 6, T98G; 7, U373MG; 8, puma en el corte ingles UW5; 9, UW15; 10, UW19.

Como lo indican los resultados de la inmunoprecipitación (IP) / transferencia Western usando un anticuerpo EGFR para IP (Fig. 1c), EGFRvIII forma un complejo con PUMA, pero no con Bax y Bmf en xenoinjertos GBM con EGFRvIII endógeno (D-270 MG y D-317 MG) y con EGFRvIII transfectado de forma estable (U87MGEGFRvIII). De manera similar, en tres líneas celulares GBM que expresan EGFR, se demostró que PUMA coinmunoprecipita con EGFR (Fig. 1d). IgG no produjo señales que indicaran especificidad de inmunoprecipitación. La interacción EGFR-PUMA se confirmó mediante IP inversa utilizando un anticuerpo PUMA (Fig. S2 en Datos suplementarios).

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